3.1 Cromatografía en capa fina.
Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 ó f366.
La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente ascenderá o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” que representan a los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.
1.1.3.5.3.2 Cromatografía en papel.
El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatográfico en el tanque cromatográfico.
1.1.3.5.3.3. Cromatografía en Columna.
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.
La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la resolución.

1.1.3.5.3.4. Cromatografía de gases.
Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.
La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separación. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias, midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico.
1.1.3.5.3.5.Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).
Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

1.1.3.5.3.6. Cromatografía de intercambio iónico.
La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.
1.1.3.5.3.7. Cromatografía por Permeabilidad en Gel.
Es útil para la separación de proteínas. La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.
1.1.3.5.3.8. Cromatografía de Afinidad.
La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.

Tipos de cromatografía
Naturaleza de fase estacionaria
Naturaleza de fase estacionaria Sólido Adsorción
Exclusión
Cambio iónico
Afinidad
Líquido Partición
Naturaleza de fase móvil Liquido Líquido-líquido ((partición)
Líquido-sólido)adsorción, cambio iónico, exclusión, Afinidad.
Gas Gas-líquido (CGL)
Gas-sólido (CGS)

Cromatografía de afinidad
Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.
Fundamento de la cromatografía de afinidad
En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.
La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas
• Alta selectividad en el mecanismo de retención
• Campo de aplicación restringido
• Separación de un solo soluto analito
• Empleo de sistema de baja presión
• Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica